屎肠球菌纤维素结合域谷氨酸脱羧酶构建及其酶学性质

摘要 为了开发可用于高效固定化的优质谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC 4.1.1.15),以Enterococcus faecium GDMCC60203为gadB基因供体,对纤维素结合域(cellulose-binding domain, CBD)GAD融合酶(CBD-GAD)的构建及其酶学性质进行了探讨。结果显示:构建的含pRPOCB-EfagadB重组质粒的Escherichia coli GDMCC 60445可高效表达CBD-GAD,120 mL发酵液制备的纤维素固定化CBD-GAD的活力为(347.93±27.63) U/g;在无氨苄青霉素LB培养基中连续培养5批,E. coli GDMCC 60445仍可稳定表达CBD-GAD;经一步纯化,CBD-GAD在SDS-PAGE电泳上呈单一条带,分子质量约为74.02 kDa; CBD-GAD最适反应pH和温度分别为4.6和60 ℃,在pH 4.8～5.6和4～40 ℃较稳定,仅对L-谷氨酸具有催化活性,Km和Vmax分别为10.58 mmol/L和3.83 μmol/(mL·min),其催化反应不受底物和产物抑制。重组菌株稳定,CBD-GAD酶学性质优良,有望应用于γ-氨基丁酸和D-谷氨酸工业化生产