高山被孢霉GDP-L-岩藻糖合成途径中GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的克隆、表达和功能鉴定

摘要 GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能.高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌.GDP-L-岩藻糖从头合成途径中的GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)能催化GDP-D-甘露糖合成GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖.对高山被孢霉中的GMD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明GDP-L-岩藻糖体内代谢的分子生物机制.首先对GMD序列进行分析,并以pET28a+质粒为骨架构建了GMD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达.进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用液相色谱-质谱法分析酶反应产物,表明纯化蛋白具有GMD活性.最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现GDP-L-岩藻糖产量在氮源耗尽后较高,可达0.10 mg/g.同时GMD的转录水平在氮源耗尽后发生了明显的上调,表明GMD在氮源耗尽后对高山被孢霉体内GDP-L-岩藻糖的合成具有重要作用.这为进一步利用高山被孢霉发酵生产GDP-L-岩藻糖和酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础