米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析

摘要 以米黑根毛霉(Rhizomucor miehei) 为出发菌株, 采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取其总RNA, 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 扩增出米黑根毛霉脂肪酶(RML) 结构基因。构建真核重组表达质粒RML-pPIC9K, 电转化His+缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115, 利用MD-MM平板及PCR方法筛选和鉴定出重组子, 进行甲醇诱导表达。结果表明, RML基因能够在巴斯德毕赤酵母中实现高效表达。重组子发酵液经SDS-PAGE分析显示获得了与预期大小(约39 kD) 一致的蛋白表达特异条带, 用NaOH滴定法测其活性, 酶活可达84 U/mL