利用red同源重组技术构建产l-苏氨酸的基因工程菌

利用red重组技术构建不同基因突变的l-苏氨酸工程菌大肠杆菌ithr，研究单敲除meta、ilva和双敲除meta、ilva基因后对l-苏氨酸积累的影响。应用质粒pkd46介导的red同源重组系统，通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因，再通过重组酶在frt位点发生第二次同源重组，消除抗性基因，成功敲除了菌株ithr体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的meta和ilva基因，构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pwye065电转化入敲除不同基因的突变株中，构建基因工程菌。经5l发酵罐发酵产酸实验，未敲除任何基因的菌株ithr/pwye065l-苏氨酸的产量为5.55±0.51g/l，meta基因单敲除菌株ithr△meta/pwye065l-苏氨酸产量为9.77±1.83g/l，ilva基因单敲除菌株ithr△ilva/pwye065l-苏氨酸产量为8.65±1.42g/l，同时敲除ilva和meta基因的菌株ithr△meta△ilva/pwye065l-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14g/l。通过敲除l-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因，可以增强l苏氨酸积累的效果，为l-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。