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生物工程学报 2013
人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备, PP. 974-985 Keywords: 视黄醇结合蛋4,(rbp4),杆状病毒表达系统,基因表达,蛋白纯化,多抗制备 Abstract: 旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(rbp4)并检测其免疫原性。将人rbp4基因片段及信号肽ss64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pfastbac-dual(pfbd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株dh10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的sf9细胞,获得含人rbp4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的sf9细胞并表达人rbp4蛋白(i-rbp4),通过sds-page和westernblotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的sf9细胞制备一批rbp4蛋白,完成sds、westernblotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与e.coli重组人rbp4(e-rbp4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组rbp4-bacmid;人rbp4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的rbp4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23kda,经过计算表达量为100mg/l;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的rbp4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血rbp4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础
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