易错pcr提高华根霉脂肪酶的热稳定性

为了提高华根霉rhizopuschinensiscctccm201021脂肪酶的热稳定性，运用定向进化-易错pcr的方法，经两轮易错pcr引入突变，利用fast-bluerr顶层琼脂法对突变文库进行筛选，第一轮易错pcr后筛选到2株突变菌株，第二轮筛选到4株突变株。第二轮最佳突变株ep2-4，其中3个氨基酸发生了突变：a129s、p168l和v329a。该突变酶ep2-4在60℃下半衰期相对原始酶r27rcl提高5.4倍，t50值提高7.8℃。酶学性质研究表明，突变酶ep2-4在热稳定性提高的基础上，仍保有良好的催化活性。蛋白质三维结构模拟显示，突变a129s可以和gln133形成氢键，增加了酶表面的亲水性和极性；p168l可以与邻近的leu164形成疏水键，导致突变酶的热稳定性提高。