蛋白酪氨酸磷酸酶shp-1/shp-2催化活性域的表达和动力学分析

为了分离纯化shp-1/shp-2催化活性域蛋白(分别命名为d1c/d2c),并估测其动力学常数,将已经构建好的d1c/d2c重组质粒转化escherichiacolibl21菌株,经iptg诱导表达、菌体裂解缓冲液悬浮和超声波破碎后,通过hplc分离纯化d1c/d2c蛋白,所得产物进行sds-page电泳检测。然后,以py作为去磷酸化反应的底物,利用孔雀绿显色法,通过双倒数作图法对纯化的d1c/d2c蛋白进行动力学分析。结果表明,本试验已成功地表达了d1c和d2c蛋白,主要以可溶性蛋白的形式表达;利用hplc技术可有效地对d1c/d2c蛋白进行分离纯化;d1c的相对分子质量为34.6kd,米氏常数km=2.04mmol/l,催化常数kcat=44.98s,特异性常数kcat/km=22.05l/(mmol·s);d2c的相对分子质量为35.3kd,米氏常数km=2.47mmol/l,催化常数kcat=27.45s,特异性常数kcat/km=11.11l/(mmol·s);d1c的磷酸酶活性较强于d2c。