表达大肠杆菌谷氨酸-1-半醛氨基转移酶对红色荧光报告蛋白尿卟啉原ⅲ甲基化酶的影响

谷氨酸-1-半醛氨基转移酶(glutamate-1-semiadhydeaminotransferase，gsat)是尿卟啉原ⅲ生物合成上游途径的一个酶，尿卟啉原ⅲ是红色荧光报告蛋白尿卟啉原ⅲ甲基化酶(uroporphyrinogenⅲmethyltransferase，upmt)的底物。为了探明大肠杆菌共表达gsat对upmt荧光强度的影响，通过pcr扩增玉米upmt基因，将其插入petduet-1质粒中第2个顺反子中，构建的载体命名为petu，表达upmt的n端含有组氨酸标签；通过pcr扩增大肠杆菌编码gsat的heml基因，定点突变去除heml基因中ncoⅰ序列，亚克隆至pet-51b质粒，再将获得的heml基因插入petu质粒的第一个顺反子中，构建petegu载体。表达gsat的n端含有strep标签。和单独表达upmt基因相比，表达2个基因后，蛋白印迹分析表明没有明显改变upmt表达量，光谱扫描分析显示没有改变荧光物质的组成，但是增强了重组细胞的红色荧光物质三甲基咕啉的含量，该物质在354nm有特异吸收。用2mmol/l的gsat抑制剂3-氨基-2,3二羟基苯甲酸处理后，表达两种酶的菌落荧光消失，表明重组gsat可能增加内源尿卟啉原ⅲ水平，从而增强重组upmt催化产生的红色荧光。