细胞内物质转运调节分子arfgap3的克隆表达及生化活性

adp核糖基化因子-gtp酶活化蛋白(arfgap)是重要的细胞内物质转运调节分子.在22周孕龄人胎肝cdna文库中发现一种新基因，其编码的氨基酸序列与大鼠arf1gap有32%同源性.将这种新基因命名为“arfgap3”，对其进行功能研究，利用逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)，从人胎盘总rna中扩增arfgap3全长cdna序列，并将其亚克隆到pgem-t载体；采用rna印迹法和斑点杂交法，检测其组织表达谱，发现在多种腺体和睾丸中有很高水平arfgap3基因转录，并且只有一种约2.7kb的转录本.利用基因重组技术，构建表达质粒pbad/thio-arfgap3，在大肠杆菌中表达，采用亲和层析法纯化表达产物，利用肠激酶切除重组融合蛋白n端引导序列.检测重组arfgap3的生化活性，证实arfgap3对arf1具有gap活性，促进arf1结合的gtp水解为gdp，磷脂酰肌醇二磷酸(pip2)增强其gap活性，而磷脂酰胆碱(pc)抑制其gap活性.