急性病毒性坏死病毒dutpase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acuteviralnecrosisvirus,avnv)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总dna为模板,pcr扩增得到编码avnvdutpase的开放阅读框orf074,将产物克隆至原核表达载体pet32a(+)中,构建表达质粒pet32a-dut。然后,将其转化至e.colibl21(de3)进行诱导表达。sds-page检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46ku,与预期表达蛋白大小一致。经western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dutpase。表达产物经co2+柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dutpase能特异性催化dutp,edta可以抑制dutpase的活性,而mg2+可以增强其活性。