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食品科学 2012
构建人cu,zn-sod毕赤酵母转化子及其高表达研究Keywords: 毕赤酵母gs115,cu,zn-sod,电转化法,高拷贝,真核表达 Abstract: ?设计人cu,zn-sod酵母偏爱密码子并化学合成,与ppic9k连接,构建酵母偏爱密码子的人cu,zn-sod基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母gs115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经southernblot鉴定,基因拷贝数提高2~8倍,活性检测显示提高2~4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,其分子质量为40kd左右,低糖基化,均为分泌表达。westernblot法分析,对cu,zn-sod抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定;cu,zn-sod转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,cu,zn-sod表达上清最高活性大于600u/ml。确立最适摇瓶培养条件为ph6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好,表明构建了高表达菌株。
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