柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的构建、表达和特性

？柑橘溃疡病(citrusbacterialcankerdisease，cbcd)是危害柑橘(citrusreticulatablanco)的重要病害，为了给柑橘溃疡病的现场快速诊断提供一种稳定的重组抗体，构建一种快速检测技术，本研究以鼠源抗柑橘溃疡病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri,xac)表面脂多糖的二硫键稳定性抗体dsfv为模板进行基因改造，利用重叠延伸pcr在其重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)之间引入一条人类抗体重链恒定区1(ch1)5'端12个氨基酸的序列作为连接肽，构建重组单链二硫键稳定抗体基因sc-dsfv。将获得的基因连接pet24a(+)载体，转入大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)得到工程菌，iptg诱导表达。表达产物经体外复性并以ni-nta亲和层析对目标蛋白sc-dsfv进行纯化，利用斑点免疫杂交、elisa和biacore检测抗体的活性、稳定性、特异性及亲和力。构建的抗体基因经测序结果表明，抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)基因之间成功引入目标连接肽序列，重组sc-dsfv蛋白实现了原核高效表达；通过体外复性和ni-nta柱纯化获得纯度高于90%的sc-dsfv蛋白。特异性和亲和性测定结果表明，该重组抗体具有特异的抗原结合活性和良好的抗原亲和力，与本实验室保存的抗柑橘溃疡病菌表面脂多糖scfv及dsfv比较，产量有明显提高且稳定性也有所提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定抗体sc-dsfv的获得为柑橘溃疡病的快速免疫诊断提供了高效优质重组抗体，并为病害治疗性抗体制备提供了有效的方法。