%0 Journal Article %T 柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的构建、表达和特性 %A 殷幼平 %A 李蒙 %A 于红 %A 吴瑜佳 %A 王中康 %J 农业生物技术学报 %P 77-84 %D 2011 %X ?柑橘溃疡病(citrusbacterialcankerdisease,cbcd)是危害柑橘(citrusreticulatablanco)的重要病害,为了给柑橘溃疡病的现场快速诊断提供一种稳定的重组抗体,构建一种快速检测技术,本研究以鼠源抗柑橘溃疡病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri,xac)表面脂多糖的二硫键稳定性抗体dsfv为模板进行基因改造,利用重叠延伸pcr在其重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)之间引入一条人类抗体重链恒定区1(ch1)5'端12个氨基酸的序列作为连接肽,构建重组单链二硫键稳定抗体基因sc-dsfv。将获得的基因连接pet24a(+)载体,转入大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)得到工程菌,iptg诱导表达。表达产物经体外复性并以ni-nta亲和层析对目标蛋白sc-dsfv进行纯化,利用斑点免疫杂交、elisa和biacore检测抗体的活性、稳定性、特异性及亲和力。构建的抗体基因经测序结果表明,抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)基因之间成功引入目标连接肽序列,重组sc-dsfv蛋白实现了原核高效表达;通过体外复性和ni-nta柱纯化获得纯度高于90%的sc-dsfv蛋白。特异性和亲和性测定结果表明,该重组抗体具有特异的抗原结合活性和良好的抗原亲和力,与本实验室保存的抗柑橘溃疡病菌表面脂多糖scfv及dsfv比较,产量有明显提高且稳定性也有所提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定抗体sc-dsfv的获得为柑橘溃疡病的快速免疫诊断提供了高效优质重组抗体,并为病害治疗性抗体制备提供了有效的方法。 %K 柑橘溃疡病菌 %K 基因改造 %K sc-dsfv重组抗体 %K 复性 %K biacore分析 %K 原核表达 %U http://www.jabiotech.org.cn/CN/abstract/abstract8332.shtml