疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

？以疏绵状嗜热丝孢菌（thermomyceslanuginosus）cdna为模板，克隆了糖化酶（gla）基因，序列分析表明gla的开放阅读框由1854个核苷酸组成，编码617个氨基酸。根据氨基酸序列推算该酶的分子量为64kda，属于糖苷水解酶第十五家族，具有该家族催化保守区的典型特征。pcr扩增gla的成熟蛋白编码基因，构建表达载体，经线性化后电击转化导入巴斯德毕赤酵母（pichiapastorisgs115），并成功进行了表达。重组酶经摇瓶发酵后酶活可达11.6u/ml，经硫酸铵沉淀、deae-sepharosefastflow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白，sds-page显示该重组蛋白大小约为67kda，比推测的蛋白分子量稍大，可能与该蛋白的糖基化有关。该重组酶的最适反应温度和最适ph值分别为60℃和5.0，该酶具有较高的热稳定性，70℃保温20min后剩余酶活为54%。