猪肝羧酸酯酶1基因的克隆和在原核细胞中的功能性表达

？为获得有活性的猪肝羧酸酯酶1（ple1）并研究其功能，利用rt-pcr与常规pcr方法，从大白猪肝组织中扩增ple1基因的orf。将ple1的orf序列连接到pet15b原核表达载体，在origamitm2(de3)中与pgro7质粒共诱导表达，纯化目的蛋白质并检测其酶活性。测序结果表明克隆到ple1基因编码区全长1686bp的片段，该片段编码562个氨基酸。sds-page和westernblotting结果显示，ple1融合蛋白质成功表达，在30℃的培养温度下，iptg诱导6h后，ple1重组蛋白质表达量最高，且大部分以可溶性形式存在。酶活性试验结果表明，ple1融合蛋白质水解底物p-npa的酶活力为1.24u。研究结果不仅为研究ple1水解兽药特性提供高纯度的具有原有酶活性的重组蛋白质，也为ple同工酶家族其他重要成员的活性功能研究提供理论依据和技术手段。