小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建

［摘要］目的？构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法？？针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列，合成相应的？短发卡RNA（shRNA）寡核苷酸序列（oligo）:Sh1、Sh2、Sh3，分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆，？抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后，与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体，利用斑形成试验测定病毒滴度。？感染C？？？3？？？H？？？10？？？T1/2细胞株，以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果？？与正常C3？H10？T1/2细胞比较，测序？及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×10？？？8？？？TU/ml;慢病毒载体对C？？？3？？？H？？？10？？？T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点？（抑制效率分别为76.8%、55.1%和11.7%）均有干扰效果，与正常细胞比较，Sh1靶点干扰效果最为显著（76.8%，P<0.05）。结论？？？？成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。