山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化

旨在克隆山羊Klf4基因，构建重组质粒pET30a-Klf4，通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA，用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列，通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体，构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Westernblotting检测确认，镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明：（1）从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因，其开放阅读框由1434个核苷酸组成，编码478个氨基酸，而且该序列与绵羊的同源性最高，达到98.5％；（2）经过SignalP4.0在线分析，Klf4的编码蛋白不存在信号肽；（3）经SDS-PAGE和Westernblotting分析表明，重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达；在变性条件下纯化，获得了His-Klf4融合蛋白。