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ISSN: 2333-9721
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硒蛋白X基因克隆、定点突变、原核表达及多克隆抗体制备

DOI: 10.3969/j.issn.1006-267x.2015.05.019

Keywords: 猪SelX基因,克隆,定点突变,原核表达,多克隆抗体

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Abstract:

本试验旨在克隆鉴定猪硒蛋白X(SelX)基因,将其定点突变后进行原核表达,获得重组蛋白,并制备猪SelX多克隆抗体,为以猪为模型SelX功能研究奠定基础。利用cDNA末端快速克隆(3'-RACE)技术从猪肝脏总RNA扩增出含开放阅读框(ORF)至poly(A)共1215bp的SelX基因cDNA片段,其348bp的ORF编码区和对应的氨基酸残基与人相应序列分别有88%和91%序列同源性,猪SelX基因提交NCBIGenBank数据库,序列号为EF113597。ORF编码氨基酸残基中硒代半胱氨酸(Sec)位于C-端第95个残基,其编码密码子TGA经定点突变为半胱氨酸(Cys)的TGT后,将其插入载体pET30,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.5mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导2h获得融合表达产物,经His-tag亲和层析后,获得分子质量为18.0ku的纯化蛋白。将纯化获得的SelX基因突变体融合蛋白(SelXm)免疫兔子,得到效价高达1:20000的多克隆抗体,免疫印迹(Western-blot)结果显示该抗体能特异性识别纯化的SelXm和猪肝脏中相应SelX。本试验成功克隆并鉴定了猪SelX基因,并制备了其多克隆抗体。

References

[1]  KVICALA J.Selenium and organism[J].Cas Lek Cesk,1999,138(4):99-106.
[2]  LOW S C,BERRY M J.Knowing when not to stop:selenocysteine incorporation in eukaryotes[J].Trends in Biochenmical Sciences,1996,21(6):203-208.
[3]  MIX H,LOBANOV A V,GLADYSHEV V N.SECIS elements in the coding regions of selenoprotein transcripts are functional in higher eukaryotes[J].Nucleic Acids Research,2007,35(2):414-423.
[4]  BOULLION R D,MOKELKE E A,WAMHOFF B R,et al.Porcine model of diabetic dyslipidemia:insulin and feed algorithms for mimicking diabetes mellitus in humans[J].Comparative Medicine,2003,53(1):42-52.
[5]  奥斯伯 F,金斯顿 R E,塞德曼 J G.精编分子生物学实验指南[M].颜子颖,王海林,译.北京:科学出版社,1998.
[6]  赵华,周继昌,李俊刚,等.应用RACE法分离和克隆猪GPX2基因研究[J].安徽农业科学,2008,36(18):7586-7588.
[7]  GILL R W,SANSEAU P.Rapid in silico cloning of genes using expressed sequence tags(ESTs)[J].Biotechnology Annual Review,2000,5:25-44.
[8]  周继昌,李黛淋,汤加勇,等.硒蛋白Sep15基因克隆、定点突变及其原核表达[J].中国生物工程杂志,2011,31(8):12-17.
[9]  李振林,夏虎,刘克荣,等.在分子克隆中用PCR进行定点突变[J].第一军医大学分校学报,2002,25(2):86-88.
[10]  周赞虎,张永祥,陈枝华,等.基因改造中快速PCR定点突变方法应用[J].中国公共卫生,2007,23(1):102-103.
[11]  KIM H-Y,GLADYSHEV V N.Methionine sulfoxide reductases:selenoprotein forms and roles in antioxidant protein repair in mammals[J].Biochemical Journal,2007,407(1):321-329.

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