小鼠肝炎病毒反向斑点杂交检测方法的建立及初步应用

目的建立一种反向斑点杂交方法（reversedotblots,RDB）以检测小鼠肝炎病毒。方法用MHV四个毒株分别感染L929细胞，收获病毒提取RNA并逆转录成cDNA；根据MHV保守区基因组序列设计引物和探针，将上游引物5′端用生物素标记。进行PCR扩增，应用PCR产物进行反向斑点杂交，优化杂交条件，进行稳定性、特异性和灵敏度实验，建立反向斑点杂交法。用此法和酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）对41只小鼠进行检测。RDB检测结果阳性样本进行T载体克隆测序。结果试剂条4℃保质期为8个月。分别检测MHV、金黄色葡萄球菌、沙门菌和乙型肝炎病毒，仅MHV为阳性，RDB特异性为100%，且MHVPCR产物最低检测限为5ng/μL。41只小鼠经本方法检测后，有5只MHV阳性，分布于3个群，而ELISA检测结果有5只阳性，分布于2个群，阳性样本T载体克隆测序结果与RDB检测结果一致。结论该方法具有简洁明了、稳定可靠、特异性好、灵敏度高等优点，可应用于实验动物小鼠肝炎病毒的检测。