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ISSN: 2333-9721
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人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

, PP. 1246-1248

Keywords: Toll样受体,克隆,真核表达,核转录因子-κB,荧光素酶

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Abstract:

目的构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpGDNA的能力。方法PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpGDNA(10mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性。结果成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpGDNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01)。结论重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpGDNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性。

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