重组羧肽酶B在胰岛素原C肽制备工艺中的应用

用RT-PCR方法克隆了大鼠羧肽酶原B的cDNA编码序列，将其重组到原核表达质粒pT7-473中，并在大肠杆菌中以包涵体方式获得高表达。SDS-PAGE电泳及灰度扫描显示表达量达菌体总蛋白的35％，表达产物融合了表达质粒上的6His。在变性条件下，经Ni-NTA柱纯化，得到羧肽酶原B，在复性液中进行稀释复性后，胰蛋白酶切得具酶活性的羧肽酶B，然后经DEAE-FF分离纯化获得较纯的羧肽酶B(28．5mg／L)，比活为13．5u／mg。用RP-HPLC分析胰蛋白酶羧肽酶B酶解胰岛素原C肽三聚体的酶解产物，证明该重组的羧肽酶B可替代提取的羧肽酶B应用于胰岛素原C肽的制备工艺中。