Evaluación de la enucleación asistida por demecolcina como método para evitar la exposición a luz UV en la producción de embriones bovinos por técnica de clonación Evaluation of demecolcine assisted enucleation as a method to avoid the UV exposure in the bovine embryos production by cloning

La clonación es una técnica con gran potencial científico y económico, aunque aún ineficiente. La luz ultravioleta (UV) utilizada durante la enucleación del ovocito genera cambios estructurales y funcionales, afectando la viabilidad de los embriones reconstituidos. El inhibidor de microtúbulos demecolcina (DMC) permite generar una protrusión visible conteniendo al núcleo del ovocito, evitando la utilización de luz UV para su ubicación y extracción. Inicialmente los ovocitos fueron tratados con 0,4μg/ml DMC durante toda la maduración in vitro (24h) o desde las 21h, obteniendo un 61,4% y 87% de núcleos ubicados en protrusión, respectivamente. En un segundo experimento los ovocitos fueron tratados con 0,4 μg/ml DMC luego de exposición a ionomicina, logrando un 52,7% de eficiencia. Finalmente, se extrajeron los núcleos de ovocitos con protrusión generados con el mejor tratamiento (DMC21h), sin exponerlos a radiación UV. Cada ovocito enucleado sin zona pelúcida fue electro-fusionado con una blastómera de un embrión FIV de 8 células. El grupo control no se expuso a DMC y se utilizó luz UV en la enucleación. No hubo diferencias estadísticas en las tasas de clivaje (67% vs 76%) ni de blastocistos (7,4% vs 3,8%) entre ambos grupos, aunque con el nuevo tratamiento la enucleación resultó técnicamente más sencillo. Cloning is a powerful scientific and economical tool, though inefficient. The ultraviolet irradiation (UV) used for oocytes enucleation generates structural and functional changes, affecting the viability of reconstructed embryos. The microtubule inhibitor demecolcina (DMC) permits the production of a cytoplasmic protrusion containing the oocyte nucleus, avoiding the UV irradiation for its identification and removal. Initially, oocytes were exposed to 0,4μg/ml DMC during whole in vitro maturation (24h) or after 21h, obtaining 61,4% and 87% of the nuclei inside a visible protrusion, respectively. In a second experiment oocytes were incubated in 0,4μg/ml DMC after ionomycin exposure, with 52,7% efficiency. Finally, protrusion nuclei formed after the best treatment (DMC21h) were removed, without UV radiation. Each enucleated and zona pelucida free oocyte was electro-fused with a blastomere from a 8 cell IVF embryo. Control group was not exposed to DMC and UV was used for the enucleation procedure. No statistical differences were observed in cleavage (67% vs 76%) nor in blastocyst rates (7,4% vs 3,8%) between both groups, although enucleation was technically easier using the new treatment