Producción de plantas transgénicas de Solanum phureja variedad yema de huevo clon 1 mediada por Agrobacteriun tumefaciens

El objetivo general de este proyecto fue la producción de plantas transformadas genéticamente de S. phureja variedad Yema de Huevo Clon 1 que sean potencialmente tolerantes a insectos, rasgo conferido por la inserción en su genoma del gen mirl2 derivado del pomelo (Citrus paradisi) que codifica para un inhibidor de proteasas de tipo Serina. Se trabajó con el sistema de transformación mediado por Agrobacterium tumefaciens utilizando la cepa LBA4404 que contiene el plásmido residente pAL4404 y el vector binario pNOV022 el cual contiene el gen de interés mirl2. Se utilizaron como explantes entrenudos con una longitud de 0,5 a 1 cm provenientes de material in vitro entre cuatro a cinco semanas de edad, los cuales fueron co-cultivados en una concentración bacteriana de 1/50, para posteriormente ser colocados en medio de regeneración sin agente de selección. Se encontró que el medio de regeneración más apropiado esta compuesto por Zeatina Ribósido (ZR 2 mg/L), ácido naftalenacético (ANA 0,04 mg/L) y ácido giberélico (AG3 0,1 mg/L) en el cual se logró obtener un 87,6% de callogénesis y un 48,6% de regeneración. Posteriormente se estableció una población de individuos potencialmente transgénicos, a partir de los cuales se realizó una extracción de DNA, organizando los extractos en pools de diez individuos, obteniéndose un total de 52 pools, a partir de 520 individuos. Se utilizaron cuatro diferentes cantidades de DNA para un volumen final de 50 μl en la PCR: 150 ng; 300 ng; 600 ng; 1.200 ng y se realizó PCR para los dos genes mirl2 (IP) y manA (PMI). Tras el análisis por electrofóresis de los resultados de la PCR para cada uno de los pools no se observó la se al de amplificación específica de los genes de interés, en tanto que se observó la se al para los genes endógenos de control. Finalmente se analizaron 62 clones provenientes de un segundo ensayo de transformación, los cuales fueron analizados individualmente. Se trabajó con una cantidad de DNA de 600 ng y se realizó PCR para los dos genes mirl2 (IP) y manA (PMI), siguiendo las mismas condiciones de trabajo. En esta segunda población de regenerantes no se observó la amplificación específica para los genes de interés, sin embargo se observó la se al para los genes endógenos de control.