定点突变提高豆豉纤溶酶的酶活力和底物特异性的研究

以pBE—DFE质粒为模板，采用反向长距离PCR技术对豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE)基因进行定点突变，使位于酶的底物结合区第156位的谷氨酸和第166位的甘氨酸分别替换为丝氨酸和丙氨酸，使临近酶的底物结合区的第169位甘氨酸残基替换为丙氨酸，获得了三个突变体E156S,G166A和G169A.将含突变基因的表达载体转化枯草杆菌WB800，构建了豆豉纤溶酶基因突变体的表达菌株WB800(E156S)；WB800(G166A)和WB800(G166A).将3种表达菌株进行液体发酵培养，结果发现发酵上清液中纤溶酶的纤溶活性为460,790和900U/mL，分别是未突变酶活性(660U/mL)的70%，115%和136%；3种突变酶对合成底物的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的酰胺水解活性是未突变酶的17%，125%和121%.