植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD^ -依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶．以拟南芥生态型“Columbia gll“及甘蓝型油菜三系“陕2A”．“陕2B”和“垦Cl”的叶片为材料．采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD—IDH不同亚基基因．同源性搜索发现，来源于油菜的克隆基因是新基因．将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点．构建表达重组体．均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白．亚基0，亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36μg／mL的二硫键异构酶的体外翻译系统，体外表达产物中检测到NAD—IDH酶活力．不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明，NAD—IDH由3种亚基组成．缺一不可．缺少亚基0是致命的，缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的．同时发现，来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象，从而发生移框突变或无义突变．使突变亚基不表现正常亚基1功能，导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异。