丙肝病毒全基因组cDNA克隆侵染细胞培养体系的建立

以含有丙肝病毒全基因组cDNA的重组质粒(pHCV)为材料，通过基因转染、重组痘病毒辅助使之在HeLa细胞中表达HCV病毒体，建立了一种新的HCV体外细胞培养系统，采用RT-PCR，荧光定量RT-PCR，链特异性RT—PCR，免疫印迹，免疫电子显微镜和电子显微镜负染技术跟踪检测HCV的增殖效率，结果显示，该培养体系中有HCV正链RNA的合成和HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达，并组装成直径约47nm的HCV病毒体，病毒体可被偶联有胶体金的抗HCV结构蛋白E2的单抗标记；该体系产生的HCV病毒体滴度达10^7基因拷贝／mL，远远高于病人血清中的HCV基因拷贝数，也高于迄今报道的任何一种HCV细胞培养体系的病毒滴度，检测结果证明，转染细胞裂解上清中的HCV病毒体可以感染肝癌细胞系Huh7，并在感染细胞中增殖和合成负链RNA中间体，病毒滴度达10^6基因拷贝／mL。