Establishment and optimization of an ISSR-PCR reaction system for Crassostrea hongkongensis
香港巨牡蛎ISSR-PCR 反应体系的建立及优化

以香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)基因组DNA为模板, 采用正交设计及单因素比较试验,分别对Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶和DNA 模板浓度的PCR 原料进行优化, 并通过温度梯度PCR, 筛选适宜的退火温度。确立了香港巨牡蛎的最适ISSR-PCR 反应体系: 25 μL 反应体系中含PCR1×Buffer, 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L 引物、1.2 U Taq DNA 聚合酶、20 ng DNA模板。反应程序为: 94℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 48～54℃(随引物而确定)退火1 min, 72℃延伸1.5 min, 35 个循环; 72℃延伸10 min。利用所建立的 ISSR-PCR 反应体系对香港巨牡蛎基因组DNA 进行扩增, 获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA 谱带, 为进一步利用ISSR 分子标记研究香港巨牡蛎的遗传多样性奠定了基础。