Site-directed mutagenesis and function analysis of glgC gene from Escherichia coli
大肠杆菌glgC基因的定点突变及功能分析

利用PCR从Escherichia coli JM109基因组中扩增到全长为1 296 bp的glgC基因编码区,通过PCR重组方法进行点突变,获得氨基酸突变的3个突变体,分别是Pro295Ser(Val121Ala,Met151Ile和Val334Asp),Gly336Asp单点突变和Pr0295Ser/Gly336Asp(Lys109Arg),其基因分别命名为295 3,336和295/336 1.将突变和未突变的基因分别克隆到pET32-a,构建重组质粒pET-glgC、pET-295 3、pET-336和pET-295/336 1,在文中分别简称为a、b、c和d.转化大肠杆菌BL21(DE3),在1 mmol/LIPTG诱导下表达.SDS-PAGE电泳分析显示,在约67 kDa处有1条明显与预期大小一致的蛋白质,表明目的基因已得到融合表达.上述转化子的碘染和糖原含量测定结果,第336位的Gly变成Asp后,宿主菌的糖原含量提高;Pr0295Ser/Gly336Asp(Lys109Arg)的突变导致宿主菌的糖原含量与Gly336Asp突变体相近,表明在336突变基因的基础上增加Pr0295Ser的突变没有进一步加大宿主菌中AGPase酶的反馈抑制效应的降低.已有的结果显示,Pr0295Ser可以降低AGPase酶的反馈抑制效应活性,而实验中295 3突变基因转入宿主菌后细胞糖原含量明显降低,推测这个结果可能是295 3中的Va1334Asp的突变造成,而334位的氨基酸可能是AGPase功能域中的一个重要位点.