Generation of a recombinant HVT virus expressing the HA gene of avian influenza virus H5N1 by Rde/ET
利用Rde/ET技术构建表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒

【目的】本研究以火鸡疱疹病毒（HVT） BAC分子克隆为平台，构建表达禽流感HA基因的重组火鸡疱疹病毒，以开发新型病毒活载体疫苗。【方法】利用Red/ET重组技术，经过两步法重组：第一步，用两端带有50 bp大小左、右同源臂a和b的选择标记基因rpsL-neo表达盒替换HVT基因组US2区；第二步，用两端带有同样的50 bp左、右同源臂a和b的HA基因表达盒替换选择标记基因rpsL-neo表达盒。在含有氯霉素和链霉素双抗性的平板上筛选阳性克隆，经卡那霉素抗性反向筛选和PCR进一步鉴定，鉴定正确的克隆命名为pHVT-HA。提取并纯化pHVT-HA DNA，转染原代鸡胚成纤维细胞（CEF），以完成重组病毒的拯救。【结果】命名为pHVT-HA3的BAC克隆转染CEF后第4天，出现病毒噬斑，噬斑形态与野生型HVT相似，获得拯救的重组病毒，命名为rHVT-HA3，将重组病毒rHVT-HA3在CEF上连续传代培养，经PCR和间接免疫荧光检测表明，重组病毒在连续传代过程中仍能稳定表达HA蛋白。【结论】本研究以HVT BAC为平台，利用Red/ET重组技术，构建了表达禽流感A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1) 毒株的血凝素（HA）基因的重组火鸡疱疹病毒，为新型禽流感重组活载体疫苗开发奠定基础。