Dual screening for targeted gene replacement mutant in Magnaporthe oryzae with GUS as negative marker
GUS为负标记的稻瘟病菌目标基因替换突变体双筛选体系

目标基因替换是基因功能研究的重要方法, 在生物工程领域广泛应用。为了提高真菌目标基因替换的效率, 以稻瘟病菌为研究对象, 建立了一种以gusA基因为负筛选标记的目标基因替换突变体双筛选体系(GUS-DS)。首先, 检测了78个真菌菌株的内源GUS活性, 发现除3个菌株外均呈阴性。同时, 将gusA基因导入稻瘟病菌、镰刀病菌、炭疽病菌后, 转化子可获得高的GUS活性。表明gusA可用作真菌中的筛选标记。然后, 以gusA为负标记, HPH为正标记, 以过氧化物酶体定位信号受体基因MGPEX5与MGPEX7的替换为例, 建立稻瘟病菌GUS-DS体系。对潮霉素抗性筛选获得的转化子通过GUS活性检测进一步筛选, 呈阴性者为可能突变体。通过PCR与Southern杂交对可能突变体进行验证, 以此评估GUS-DS的筛选效率。结果表明GUS-DS将Δmgpex5与Δmgpex7的筛选效率由原来的65.8%和31.2%分别提高到90.6%和82.8%。另外, 还建立了一种适合于GUS-DS的多重PCR法(M-PCR)用于突变体的验证。通过扩增目标位点的不同区段, 可以有效区分突变体、野生型和随机插入转化子。M-PCR法验证突变体简便、迅速, 可信度与Southern杂交相同。GUS-DS及M-PCR为功能基因组学及生物工程的研究提供了有力的工具。