Expression and purification of human β-secretase (BACE1) in Pichia pastoris
人β-分泌酶 (BACE1) 在毕赤酵母中分泌表达及纯化

为了获得活性良好的重组人β-分泌酶 (β-secreatase, BACE1)，用于研究其与抑制剂的作用模式，构建了携带β-分泌酶proBACE1和BACE1编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46，通过电击法转入毕赤酵母GS115中，分别得到重组子9k-B22和9k-B46。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达，结果显示9k-B22的上清活性明显高于9k-B46的上清活性。9k-B22表达上清浓缩后经HisTrap亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的BACE1活性, SDS-PAGE/高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白，并且其糖基侧链可以被Endo Hf完全切除，得到50 kDa左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现，这两个蛋白分别与proBACE1和BACE1匹配。活性检测发现糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK-293细胞表达的商品BACE1，这说明糖基化及其类型对BACE1的活性非常重要。然而已知的BACE1抑制剂对三者的抑制率无显著差异，这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化BACE1纯化产量提高到1 mg/L，这为发现并优化BACE1新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。