Optimization of the expression of human DNA topoisomerase I in Pichia pastoris]
人DNA 拓扑异构酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTopoⅠ)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选，用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopoⅠ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达，表达产物可分泌到发酵上清，易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母(SMD-hTopoⅠ)分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母(X33-hTopoⅠ和KM-hTopoⅠ)更高。通过发酵条件的优化，使用BMMY(pH7．25)，于20℃，每隔24h补加0．5％(V/V)的甲醇和3％(V/V)的营养液，SMD-hTopoⅠ诱导72h后可表达最高的酶活力(43000u/mL)，发酵上清中hTopoⅠ可达11mg/L，约占总蛋白的10％。SDS-PAGE和Westem blot分析显示，表达的hTopoⅠ为91kD蛋白，无糖基化修饰。