Rapid Disruption of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus orf60 by Red Recombination System
利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid，将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中，获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂，长45bp；3′端长18bp，为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列），以pKD3质粒（含cat）为模板，PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat，即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株，在Red重组酶的作用下，线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物，用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后，Western blot分析未检测到orf60基因的表达。