蚯蚓纤溶酶基因（Efp-Ⅰ）在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme，EFE）基因序列中，只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物，通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因（GenBank，DQ418454）。序列分析证明，由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示，该基因与AY438624相似性极高，二者均属于胰蛋白酶家族；不同的是，该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域，所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上，构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ，并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明，表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性，是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白（MBP-EfP-Ⅰ）。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ，在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。