免疫磁珠及无血清悬浮培养法对肝癌干细胞的分离与富集

目的 评估免疫磁珠分选技术分选肝癌干细胞的效率。 方法 ① CD90 的表达检测：采用免疫组织化学染色 SP 法检测 8 例正常肝组织、58 例肝癌及其癌旁组织中 CD90 的表达。② 细胞系筛选：将 Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721 及 Bel7402 细胞系分为空白对照组和实验组（细胞数量均为 5.5×105 个，均为 1 孔），实验组细胞中加入 5 μL CD90–PE 抗体，空白对照组加入 5 μL CD90– 无荧光抗体。采用流式细胞术检测 4 种细胞系空白对照组和实验组的 CD90+ 细胞比例，以筛选细胞。③ 免疫磁珠分选：将 Huh-7 和 MHCC97-H 细胞系分别进行磁珠标记后进行磁珠分选。收集流经磁珠分选柱（MS）后的细胞悬液 1 mL，作为 CD90– 组；将 MS 移出磁场区域，加入 1 mL PBS 缓冲液快速冲洗至离心管中，标记为 CD90+ 组；以未分选细胞作为空白对照组（加入 CD90– 无荧光抗体）和未分选实验组（加入 CD90–PE 抗体）。对 Huh-7 细胞系进行二次分选。采用流式细胞仪检测 4 组细胞中的 CD90+ 细胞比例。④ 无血清培养和含血清培养：将 Huh-7 细胞接种到无血清培养基专用 6 孔板中进行培养（无血清和含血清悬浮培养均为 1 孔），1 周后采用流式细胞仪检测无血清培养和含血清培养后细胞中的 CD90+ 细胞比例。 结果 ① 正常肝组织中 CD90 的表达阳性率为 0（0/8），肝癌组织为 65.5%（38/58），癌旁组织为 20.7%（12/58）。肝癌组织中 CD90 的表达阳性率较正常肝组织（χ2=6.78，P<0.05）和癌旁组织高（χ2=20.83，P<0.05）。② Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721 及 Bel7402 细胞系中实验组的 CD90+细胞比例分别为 0.851%、1.090%、2.710% 及 4.050%，空白对照组分别为 0.241%、0.688%、1.890% 及 2.080%，故选择 Huh-7 和 MHCC97-H 细胞系进行下一步的免疫磁珠分选。③ Huh-7 细胞经一次分选后：未分选空白对照组的 CD90+ 细胞比例为 0.241%，未分选实验组为 0.851%，CD90– 组为 0.574%，CD90+ 组为 1.100%；二次分选后：未分选空白对照组的 CD90+ 细胞比例为 0.032%，未分选实验组为 0.961%，CD90– 组为 0.426%，CD90+ 组为 9.700%。 结论 正常肝组织实质细胞不表达 CD90，肝癌组织高表达 CD90。肝癌细胞系 Huh-7 和 MHCC97-H 中存在少量的 CD90+ 细胞，免疫磁珠分选法能明显提高 CD90+ 细胞比例，但作用十分有限。无血清悬浮培养法对富集 CD90+ 细胞无明显作用