AMPK 通过调控 mTOR/Nix 信号通路参与小鼠肝缺血-再灌注损伤

目的 探讨腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）在肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）中的作用机制。 方法 ① 分组。将 42 只小鼠随机分为假手术组（Sham 组）、4 个时点缺血-再灌注（IR）组（2、6、12 及 24 h）、Compound C 组及 Compound C+雷帕霉素（Rapa）组，每组6 只小鼠。Compound C 组：腹腔注射 Compound C（25 mg/kg）1 h 后，建模。Compound C+Rapa 组：腹腔注射 Rapa（1 mg/kg）和 Compound C（25 mg/kg）1 h 后，建模。4 个时点 IR 组、Compound C 组和 Compound C+Rapa 组小鼠制备 HIRI 模型。Sham 组小鼠仅行开腹、游离第一肝门以及关腹操作。② IR 最佳时点筛选。检测 Sham 组和4 个时点 IR 组小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）浓度，取肝组织行 HE 染色观察肝组织的病理学改变，并采用蛋白印迹法检测小鼠肝组织中自噬、凋亡相关蛋白的表达。综合血生化检测结果、HE 染色结果和蛋白印迹实验结果确定 IR 最佳观察时点。③ AMPK 机制研究。取 IR-12 h 组、Compound C 组（建模后 12 h）和 Compound C+Rapa 组（建模后 12 h）小鼠肝脏组织，行免疫组化染色观察增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，行罗丹明 123 染色观察线粒体损伤情况，行蛋白印迹实验检测自噬、凋亡相关蛋白的表达，行末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记测定法（TUNEL 法）检测肝脏细胞的凋亡情况。 结果 ① IR 后 12 h 为最佳观察时点。与 IR-12 h 组比较，Sham 组，IR-2、6 及 24 h 组的 ALT 和 AST 浓度均较低（P<0.05）；HE 染色结果示 IR-12 h 组小鼠的肝组织结构破坏最为严重；蛋白印迹实验结果示，与 IR-12 h 组比较，Sham 组，IR-2、6 及 24 h 组的 AMPKα、磷酸化型腺苷酸活化蛋白激酶 α（p-AMPKα）、Nip3 样蛋白 X（Nix）及 BCL-2 同源的水溶性相关蛋白（Bax）的表达水平，以及自噬微管相关蛋白轻链 3（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ比值均较低（P<0.05），而磷酸化型哺乳动物 Rapa 靶蛋白（p-mTOR）的表达水平均较高（P<0.05）。因此 IR 12 h 为最佳观察时点。② 与 IR-12 h 组比较，Compound C 组小鼠肝组织中 PCNA 的表达水平较低（P<0.05），线粒体发光强度较弱，凋亡细胞较多；与 Compound C 组比较，Compound C+Rapa 组小鼠肝组织中 PCNA 的表达水平较高（P<0.05），线粒体发光强度较强，凋亡细胞较少。③与 IR-12 h 组比较，Compound C 组小鼠肝组织中 Nix 及 p-AMPKα 的表达水平和 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均降低（P<0.05），而 p-mTOR、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3） 及 分裂型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved Caspase-3）的表达水平均升高（P<0.05）；与 Compound C 组比较，Compound C+Rapa 组小鼠肝组织中 p-AMPKα 和 Nix 的表达水平均升高（P<0.05），而 p-mTOR、Caspase-3 和 Cleaved Caspase-3 的表达水平均降低（P<0.05）。 结论 在小鼠 HIRI 过程中，AMPK 通过 m-TOR/Nix 通路调节线粒体自噬和凋亡