生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定呋喃 西林代谢物

目的 建立竞争生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(biotin-avidin enzyme linked immumosobent assay, BA-ELISA)检测呋喃西林代谢物。方法 采用棋盘法确定单克隆抗体和包被原的最佳稀释倍数, 通过单因素试验优化辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-horseradish peroxidase, SA-HRP)稀释倍数、封闭液浓度、竞争反应时间、生物素标记羊抗鼠二抗(biotinylated goat anti-mouse ImmunoglobulinG, Biotin-IgG)孵育时间、SA-HRP孵育时间和显色时间, 建立标准曲线, 并对方法的灵敏度、特异性、准确度和精密度进行方法学评价。结果 最佳实验条件为: 包被原稀释倍数为1:800, 单克隆抗体稀释倍数为1:12800, SA-HRP稀释倍数为1:8000, 封闭液为1%的脱脂乳, 竞争反应时间为30 min, Biotin-IgG孵育时间为30 min, SA-HRP孵育时间为60 min, 显色时间为15 min; 在优化条件下, 线性方程为Y=-0.3299X+0.4272 (r2=0.990), IC50为0.601 ng/mL, 线性范围为0.074~4.883 ng/mL; 加标回收率为88.8%~98.5%, 批内变异系数(coefficient of variation, CV)和批间CV分别为1.2%~3.6%和2.5%~5.1%, 建立的方法与其他结构类似物及衍生化试剂的交叉反应率(cross reactivity, CR)均小于0.1%。BA-ELISA与高效液相色谱-串联质谱法的回收率均在85%~115%范围内