基于蛋白损伤污染物毒性评价的luxCDABE生物发光载体的构建

目的 构建含完整luxCDABE基因盒的PUCD-dnaK重组发光载体, 用于对蛋白损伤污染进行毒性评价。方法 用PCR法从大肠杆菌W3110中扩增dnaK基因, 将PCR产物测序后与GenBank中dnaK序列进行BLAST比对。将dnaK片段及PUCD615载体均用BamH I、EcoR I双酶切, 连接后电转化导入宿主菌JM109。挑取克隆, 提取质粒用PCR鉴定, 阳性克隆再进行测序。结果 dnaK基因PCR扩增产物得到206 bp片段, PCR产物测序后BLAST比对同源性为100%, 表明扩增序列正确。PUCD-dnaK测序结果表明序列含有dnaK基因及PUCD615载体上的基因, 且与载体连接处正确地出现对应的酶切位点。结论 PUCD-dnaK载体构建成功。含luxCDABE全基因盒作为报告基因的载体PUCD615可克服luxAB必须外加底物(脂肪醛)才能实现生物发光的缺点, 通过优化连接及转化条件, 可将大片段的PUCD615载体与短片段的插入序列连接成功, 构成重组 载体