STEC 多重PCR的建立及在牛胴体检测中的应用

【目的】建立检测产志贺毒素性大肠杆菌(Shiga-toxin-producing Escherichia coli, STEC)主要血清型O26、O145、O45和O121的多重PCR。【方法】根据GenBank登录序列,设计编码O抗原翻转酶(wzx)基因的特异性引物,建立PCR,并以STEC O26、O145、O45和O121基因组为模板,检验多重PCR的敏感性和特异性。使用建立的PCR,检测牛胴体表面拭子,阳性扩增条带送测序,以验证PCR扩增的可靠性。同时将阳性扩增样品,涂布显色平板,分离靶标血清型细菌。【结果】本研究成功建立STEC O26、O145、O45和O121的多重PCR,PCR循环参数中退火温度为60 ℃,扩增片段分别为249 bp、353 bp、890 bp和587 bp。多重PCR直接检测STEC O26、O145、O45和O121时,最低检测限介于103-104CFU/mL,而增菌后再检测,最低检测限均为1CFU/mL。多重PCR用于其他血清型STEC,和非大肠杆菌扩增时,均未扩增出目的条带,只有STEC O26、O145、O45和O121能够扩增出相应条带。当使用多重PCR直接检测胴体擦拭子时,阳性率为5.45%(3/55),主要为O26、O145血清型；増菌后检测阳性率为12.73%(7/55),主要为O26、O145和O121血清型。阳性PCR扩增样品,成功分离到STEC O26两株、O145和O121各一株。分离菌株具有典型大肠杆菌的生化特性,携带STEC代表性毒力因子志贺毒素和紧密素,且具有多重耐药性。【结论】以STEC O26、O145、O45和O121的wzx基因为检测靶标,成功建立多重PCR,敏感性和特异性良好,与细菌分离联合使用,可减少工作量,精准分离目的病原菌