滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的 克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SE）基因，并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法 以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物，对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中，经测序鉴定正确后，构建pEASY-E1-SE表达载体，利用ArtMedia protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果 获得了2条滇重楼SE基因，命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp，开放阅读框（ORF）为1 578 bp，编码525个AA；ppSE2的全长为1 828 bp，ORF长为1 548 bp，编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异，ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明，原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功；SDS-PAGE分析显示，在BL21（DE3）表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论 克隆了滇重楼的SE基因，获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式，在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用