桑黄鲨烯环氧酶基因原核表达及过表达载体的构建

目的 构建桑黄三萜生物合成途径中的关键酶――鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SE）基因的原核表达和过表达载体。方法 将克隆到的桑黄SE基因构建到原核表达载体pET-32a （+）上，转化大肠杆菌BL21（DE3），使用异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达2~10 h后，通过SDS-PAGE进行检测。根据GenBank中提交的香菇3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（gpd）启动子序列设计引物，利用PCR技术克隆获得香菇gpd启动子片段，以植物双元表达载体pCAMBIA1301为基础载体，通过酶切、连接等方法将其中的35 S启动子替换为香菇gpd启动子，再将SE基因编码区序列构建到gpd启动子下游，构建桑黄SE基因的过表达载体。结果 成功构建了SE基因的原核表达载体pET-32a-SE，SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约为55 000，与预测的蛋白相对分子质量基本一致。PCR检测、酶切鉴定和测序分析可知，成功构建了适宜食用菌遗传转化的中间载体pCAMBIA1301-gpd-gpd及SE基因的过表达载体pCAMBIA1301-gpd-gpd-SE。结论 为后期研究SE基因在桑黄三萜生物合成方面所发挥的功能奠定基础