利用EMAqPCR建立快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法

利用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMAqPCR),建立了一种有效快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法。以猕猴桃溃疡病菌ITS序列为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行qPCR特异性扩增。结果显示,qPCR检测灵敏度为2 cfu;当EMA的浓度为2.0 μg/mL时,能有效抑制1.0×107 cfu/mL经高温灭活的死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×101~1.0×105 cfu范围内,每个qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R2=0.988)。不同温度处理活菌菌悬液后用EMAqPCR检测猕猴桃溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,结果表明待检样品可在4℃和20℃短期保存。对疑似带病猕猴桃材料进行EMAqPCR检测,结果表明能减少猕猴桃溃疡病菌PCR的假阳性结果。本研究建立的EMAqPCR方法是一种有效检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果