应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达

[目的]对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）基因进行定向进化，筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶。[方法]采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变，建立酶基因突变文库，筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体，并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。[结果]通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9，其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍，可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明，突变体ep-9有3个碱基发生了变化：G2005A/A2037G/T2081G，其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变。SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明，2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中。酶学性质测定表明：突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍，总环化比活力提高了34%，Km值由4.3 g/L降低到3.74 g/L；在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A。[结论]本试验表明：基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化，G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用，这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义