D-乳酸生产菌菊糖芽孢乳杆菌来源的D-乳酸脱氢酶同工酶

[目的] 菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）作为典型的同型发酵产D-乳酸的优势菌株，能够高效生产高纯度的D-乳酸。该菌株发酵受到多方面环境因素影响。糖代谢的关键酶例如葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶以及乳酸脱氢酶均为由葡萄糖代谢成为乳酸的关键酶，该菌中相关代谢酶的研究是发酵调控至关重要的基础。分析S.inulinus的基因组表明有3个推测为D-乳酸脱氢酶的基因，其中已有报道研究了1个双功能蛋白[bifunctional protein（BP）]。本研究分别克隆并解析了另2个D-乳酸脱氢酶同工酶的性质。[方法] 本研究以S.inulinus Y2-8基因组DNA为模板，克隆得到2个D-ldh基因（dldh、dhdh），经测序分别为D-乳酸脱氢酶[D-lactic acid dehydrogenase（DLDH）]和D-羟基酸脱氢酶[D-isomerspecific 2-hydroxyacid dehydrogenase（DHDH）]的基因。构建的重组菌表达蛋白DLDH，DHDH均具有催化丙酮酸生成D-乳酸的功能。[结果] 重组菌表达的蛋白经镍柱亲和层析达到电泳纯。SDS-PAGE分析表明DLDH的表观分子量为37 kDa，DHDH的表观分子量为39 kDa。此外，DLDH以丙酮酸为底物时Km值为（0.58±0.04）mmol/L，对底物有较高的亲和力，最适反应温度为35℃，最适pH为6.5；而DHDH以丙酮酸为底物时Km值为（1.70±0.08）mmol/L最适反应温度为30℃，最适pH为7.5。另有报道的BP以丙酮酸为底物时Km值为（3.40±0.02）mmol/L，最适反应温度为30℃，最适pH为5.5。[结论] 根据对底物丙酮酸的亲和力，最适温度及最适pH，推测DLDH是乳酸发酵中产D-乳酸的主导催化剂。结合相关酶学性质的分析可为今后的发酵调控提供理论依据