一个新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因的分析和突变

[目的]完成一个来源于碱性污染土壤宏基因组文库的新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因undec1A的鉴定，研究其酶学性质并利用非理性设计技术对其进行分子改造。[方法]以pETBlue-2为表达载体构建包含undec1A基因的重组表达质粒，转化至宿主细胞E.coli Tuner（DE3） pLacI中构建重组表达克隆，采用镍亲和层析完成了酶蛋白的分离纯化，完成其生化特征研究，利用连续易错PCR技术对Undec1A蛋白进行分子改造。[结果]生物信息学分析结果揭示Undec1A蛋白与已知的L-半胱亚磺酸脱羧酶存在类似的辅酶结合位点和底物识别催化基序等。分子对接结果显示氨基酸残基Val237、Asp239、Asp266、Ile267、Ala268和Lys298等决定了与底物分子L-半胱亚磺酸的识别和结合催化。以L-半胱亚磺酸作为底物，重组Undec1A蛋白的最适作用pH为7.0，最适作用温度为35℃；分子动力学常数Km为（1.557±0.015） mmol/L，Vmax为（49.07±3.19）μmol/（L·min），kcat为（45.80 ±1.32）/min。利用连续易错PCR技术完成了亲本酶的分子改造，分离筛选到了一个酶活力更高的突变酶Undec1A-1180。在优化条件下，Undec1A-1180的比活力较亲本酶提高了约5.62倍。[结论]本研究为构建牛磺酸的生物合成工艺提供了理论参考，因而具有重要的实践意义