双退火温度PCR扩增DNA

[目的]与设置单一退火温度的常规PCR（S-Tm PCR）不同，本研究探讨双退火温度PCR（D-Tm PCR）由高到低设置2条引物各自退火温度。[方法]以PxF61和VPel为正/反向引物，用Q5 DNA聚合酶扩增4.3 kb的模式DNA pET20b-Xyn（黑曲霉木聚糖酶基因）。PCR程序为：98℃预变性3 min，30次循环{98℃变性30 s，设置双退火[Tm1 70℃（PxF61）退火15 s、Tm2 62℃（VPel）退火15 s]，72℃延伸130 s}。[结果]与S-Tm PCR（61℃）相比，D-Tm PCR扩增4.3 kb的目的条带亮度更高，减少2条杂带；经25次循环目的DNA产物量最高。D-Tm PCR用于长片段引物扩增5.3 kb重组质粒DNA条带更明显。[结论]D-Tm PCR直接扩增目的条带，避免了探讨Tm的麻烦，不要求2条引物Tm相近，从理论上更加清晰地认识引物与各自模板分步退火过程