多点突变提高DhaA对芥子气的活性和热稳定性

为提高烷基卤脱卤酶DhaA对芥子气的活性和热稳定性，采用Autodock软件计算DhaA突变前后与芥子气的结合情况，利用重叠延伸PCR和DNA无缝拼接结合的方法，改变DhaA活性空腔进出口通道的大小，构建包含5个位点的DhaA突变体（Ile135Phe + Cys176Tyr + Val245Phe + Leu246Ile + Tyr273Phe）；将DhaA及其突变体构建在pET-28a载体上后，在Escherichia coli BL21 (DE3)中进行表达，比较纯化后的野生型与突变体在酶学性质方面的变化情况. Autodock分子对接结果显示，突变后的DhaA与芥子气的结合能、结合效率和抑制常数均小于野生酶，突变体对芥子气的比活性提高了1.4倍，对10 mg/mL芥子气的降解率提高了近20%. 热稳定性实验发现，DhaA突变体在50 ℃水浴1 h后残余酶活为76%，比野生型DhaA提高了19%. DhaA突变体的Tm值为56 ℃，比野生型DhaA提高了6 ℃. 综上表明改变DhaA活性空腔内的进出口通道可以提高DhaA的热稳定性和对芥子气的催化活性. （图11 表2 参10