Halomonas socia NY-011T中四氢嘧啶合成基因簇ectABC和ectD的克隆及其功能鉴定

EctA、ectB、ectC和ectD编码的酶可以催化对细胞起保护作用的四氢嘧啶类物质的生物合成，Halomonas socia NY-011T ectABC和ectD为四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生产提供新的来源. 通过SEFA-PCR步移方法从Halomonas socia NY-011T中克隆ectA、ectB、ectC和ectD基因，并分别构建ectABC和ectD的原核表达质粒，在E. coli BL21(DE3)中异源表达，利用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定，通过ACQUITY UPLC MS/MS检测四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生成. 结果显示：H. socia NY-011T的四氢嘧啶合成基因ectA、ectB、ectC形成基因簇ectABC（KP717055-57），大小为2 506 bp，四氢嘧啶羟化酶基因ectD大小为942 bp（KP717058），与近源种H. elongata DSM258同源性分别为81%和78%；SDS-PAGE检测到4种融合蛋白，大小（Mr）分别为21.6 × 103、46.4 × 103、14.4 × 103、55.3 × 103，与预期相符；利用ACQUITY UPLC MS/MS发现仅表达ectABC的重组菌株[E. coli BL21(DE3)/pltac-ABC]中只存在四氢嘧啶，而在表达ectABC和ectD的重组菌株[E. coli BL21(DE3)/pltac-ABC/pETectD]中检测到四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶. 本研究从新种H. socia NY-011T中分离得到的四氢嘧啶类物质的合成基因，能够在E. coli BL21 (DE3)中异源表达并行使功能，为四氢嘧啶类物质异源生产提供了新的基因来源. （图5 表1 参22