深黄被孢霉苹果酸酶基因的克隆和表达

为了克隆与表达深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22苹果酸酶基因，根据深黄被孢霉M6-22转录组测序结果，以其cDNA为模板PCR扩增苹果酸酶基因编码序列，经测序验证分析后将扩增片段连接到表达载体pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET32aMIME2并进一步转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，经镍柱亲和纯化目的蛋白和酶活分析确定其为苹果酸酶. PCR扩增得到全长为1 815 bp的cDNA序列，序列分析表明该序列具有一个编码604个氨基酸的开放阅读框，预测编码蛋白分子量（Mr）为66.4 × 103. 预测的氨基酸序列与已报道的苹果酸酶同样具有保守的2个二核苷酸结合结构域和1个二价金属离子结合结构域，因此是一个新的苹果酸酶基因序列，命名为MIME2，GenBank序列号为KU097323. 将该序列转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达，SDS-PAGE电泳检测到1条约67 × 103的蛋白条带表达，经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱氢生成丙酮酸，同时生成NADPH，具有苹果酸酶的特性，其酶活大小为177.46 U/mg. 以上结果证明所克隆的cDNA序列MIME2为1个新的苹果酸酶基因，基因编码蛋白具有苹果酸酶活性，可为深入研究苹果酸酶的结构和功能关系以及进一步应用奠定基础. （图4 参20