CRISPR/Cas9介导的外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组

本研究旨在通过CRISPR/Cas9介导外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组。首先设计特异性引物并扩增鸡内源性病毒 (EAV-HP) 左右同源臂和增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 基因表达盒，然后通过重叠延伸PCR技术将两个同源臂DNA连接至eGFP表达盒两侧，获得全长DNA片段LER，并克隆至pMD19-T载体，获得携带eGFP基因的供体载体pMDT-LER。随后在HEK293T细胞中验证供体载体pMDT-LER能成功表达eGFP后，将EAV-HP打靶载体和供体载体共转染至DF-1细胞，观察绿色荧光阳性细胞，提取细胞基因组，PCR检测外源基因eGFP成功整合至鸡基因组EAV-HP位点。最后，将转基因细胞DF-1传至第7代，用PCR和Western blotting检测eGFP在转基因细胞中稳定表达。文中初步验证外源基因eGFP能整合至鸡EAV-HP位点并稳定表达，为转基因鸡的研究提供新整合位点